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Dec 19, 2023

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 885 (2023) Citer cet article

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Les cnidocytes sont les cellules piquantes explosives propres aux cnidaires (coraux, méduses, etc.). Spécialisés pour la capture et la défense des proies, les cnidocytes comprennent un groupe de plus de 30 types cellulaires morphologiquement et fonctionnellement distincts. Ces cellules inhabituelles sont des exemples emblématiques de nouveauté biologique, mais les mécanismes de développement à l'origine de la diversité de l'appareil piquant sont mal caractérisés, ce qui rend difficile la compréhension de l'histoire évolutive des cellules piquantes. En utilisant l'édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 chez l'anémone de mer Nematostella vectensis, nous montrons qu'un seul facteur de transcription (NvSox2) agit comme un commutateur binaire entre deux destins alternatifs de cellules piquantes. Le knock-out de NvSox2 provoque une transformation des cellules perçantes en cellules piégeantes, qui sont courantes chez d'autres espèces d'anémones de mer mais semblent avoir été réduites au silence chez N. vectensis. Ces résultats révèlent un cas inhabituel d'atavisme unicellulaire et élargissent notre compréhension de la diversification de l'identité du type cellulaire.

Les nouveaux types cellulaires favorisent l'origine de nouvelles fonctions physiologiques et sont essentiels à l'expansion de la diversité des organismes ; pourtant, comprendre les mécanismes à l'origine de l'origine de nouveaux types de cellules est un défi persistant en biologie1,2. Des études sur l'évolution des traits dans les organismes multicellulaires ont identifié « l'homéose » - la transformation d'une partie d'un organisme en une autre partie3 - comme une source importante d'innovation morphologique. Des exemples courants de ces nouveautés homéotiques incluent la conversion des pétales en sépales chez les plantes à fleurs et la transformation des segments abdominaux en segments thoraciques chez les insectes4. Il a depuis été démontré que ces transformations sont contrôlées par des gènes régulateurs exprimés au niveau régional5,6, démontrant comment le développement de phénotypes complexes peut être coordonné par un seul commutateur génétique. Plus récemment, l'homéose a été invoquée pour expliquer comment des transformations peuvent se produire au niveau d'une seule cellule. Des études sur la différenciation neuronale chez les nématodes, les mouches et les vertébrés ont identifié des gènes régulateurs individuels suffisants pour convertir un sous-type neuronal en un autre, soutenant l'idée que l'homéose peut contrôler l'individuation du destin cellulaire7. À ce jour, cependant, aucune étude n'a démontré l'induction homéotique de l'atavisme - la réémergence d'un caractère ancestral - au niveau d'un type cellulaire individuel. Une telle démonstration fournirait une compréhension mécaniste de la façon dont l'homéose pourrait conduire à la diversification des types de cellules et favoriser l'expansion de la complexité animale.

Les cellules piquantes (cnidocytes) sont parmi les plus complexes morphologiquement de tous les types de cellules et sont un exemple emblématique d'une nouveauté cellulaire (Fig. 1). Trouvées exclusivement chez les cnidaires (un clade qui comprend les coraux, les méduses et leurs proches), les cellules urticantes comprennent un large éventail de cellules spécialisées dans la capture de proies, la défense et l'utilisation de l'habitat qui varient considérablement en forme et en fonction selon les taxons8. En effet, la suite de types de cellules piquantes trouvées dans chaque espèce de cnidaire est sans doute le caractère diagnostique le plus informatif pour les taxons à corps mou, qui comprennent plus des 2/3 des 13 000 espèces de cnidaires existantes9,10. Trois sous-types majeurs de cellules piquantes sont actuellement reconnus et peuvent être distingués par la morphologie de leur organite piquant11. Les premiers, les nématocytes ("cellules perçantes") (Fig. 1a–c, g, h), ont un organite explosif avec une paroi de capsule épaisse contenant un tubule éversible chargé de venin12,13,14,15. Chez les cnidaires, plus de 30 types différents de nématocytes ont été décrits, différant largement par la morphologie de la partie basale et épineuse du tubule (ci-après appelé le "harpon")8. Le deuxième type de cellules urticantes, les spirocytes (« cellules piégeantes »), présentent beaucoup moins de variation morphologique et sont décrits comme graciles (minces) ou robustes (épais) en apparence16. Bien qu'encore extrusives, ces cellules sont caractérisées par deux traits que l'on ne retrouve pas dans les cellules perforantes : une paroi de capsule mince d'aspect dentelé, dérivée d'un réseau de fibres régulièrement espacées tapissant la paroi interne de la capsule, et un tubule éversible orné de fines tiges latérales qui créent une toile enserrante lors de la décharge17 (Fig. 1d – f, i). Le troisième groupe de cellules piquantes, les ptychocytes ("cellules adhérentes"), ne sont pas connus pour contenir des toxines et leur charge utile se compose uniquement d'un tubule plissé et collant replié à l'intérieur d'une capsule à paroi mince18 (Fig. 1j – l). La large distribution des cellules perçantes (nématocytes) dans tout le phylum suggère que ce type de cellule était présent chez le dernier ancêtre commun des cnidaires (Fig. 1m). La distribution plus restreinte des types de cellules capturantes et adhérentes (spirocytes et ptychocytes, respectivement) implique que ces types de cellules ont évolué à partir d'un ancêtre perçant. Cependant, les mécanismes de développement contrôlant la variabilité de la morphologie de l'appareil de piqûre n'ont pas été caractérisés. Les facteurs évolutifs à l'origine de la diversification de ces types de cellules inhabituels restent donc non résolus.

a, b Nématocyte déchargé (SEM) du mésentère de l'anémone de mer Nematostella vectensis montrant des volets apicaux (b - vert, fausse couleur) et des épines le long du harpon éversé (flèche blanche). c Apex du nématocyte non déchargé (TEM) du mésentère de N. vectensis montrant des volets apicaux (vert) et une paroi de capsule épaisse (têtes de flèches). d Spirocytes déchargés (SEM) des tentacules de l'anémone de mer Calliactis tricolor montrant l'absence de lambeaux apicaux et l'absence d'épines sur le tubule éversé (flèche blanche). e, f Spirocytes non déchargés (TEM) des tentacules de N. vectensis montrant une calotte apicale (orange, fausse couleur) et une paroi de capsule fine et dentelée (têtes de flèches blanches). L'aspect dentelé de la paroi de la capsule des spirocytes provient d'un réseau interne de fibres régulièrement espacées (têtes de flèches blanches en f). De fines tiges latérales ornent le tubule et apparaissent sous la forme de petits points noirs en coupe transversale (pointe de flèche noire en e). g, h SEM d'une capsule de nématocyste cassée de N. vectensis montrant la paroi épaisse de la capsule (têtes de flèches noires). i Capsule intacte de spirocytes de N. vectensis ; les bobines du tubule sont visibles à travers la paroi mince de la capsule (deux bobines sont délimitées par des lignes pointillées). j Ptychocyte déchargé (SEM) de la paroi corporelle de l'anémone tubulaire Ceriantheopsis americana; le tubule éversé est dépourvu d'épines mais présente des plis longitudinaux (flèche blanche). k Apex de ptychocyte non déchargé de la paroi corporelle de C. americana ne montrant aucune spécialisation (violet, fausse couleur). l Coupe transversale d'un tubule plissé à l'intérieur de la capsule d'un ptychocyte non déchargé de C. americana; la paroi de la capsule est fine et non dentelée (têtes de flèches blanches). m Cladogramme des cnidaires, d'après Kayal et al.10 ; les cases à droite indiquent la présence (gris) ou l'absence (blanc) de chaque type de cellule piquante. Les origines hypothétiques des trois types de cellules piquantes sont tracées sur l'arbre. Le gris pointillé reflète les cellules urticantes hautement dérivées des myxozoaires. nématocyte N, spirocyte S, ptychocyte P. *Hexacoraux non cérianthidés ; ce clade n'a pas actuellement de nom accepté. +Myxozoaires et Polypodium.

Les gènes Sox sont une famille de facteurs de transcription qui jouent un rôle instructif dans les décisions concernant le destin cellulaire chez les animaux19. L'expression restreinte aux tissus de divers orthologues Sox a déjà été démontrée chez les cnidaires et est cohérente avec le rôle de ces facteurs de transcription dans la structuration de types cellulaires distincts20,21,22,23,24. Ici, nous montrons qu'un seul gène Sox, NvSox2, régule un commutateur homéotique entre deux destins alternatifs de cellules piquantes : percer et piéger. Interprétés dans le contexte de la phylogénie des anémones de mer, ces résultats expliquent la distribution discontinue de types distincts de cellules piquantes chez les cnidaires et suggèrent que l'atavisme unicellulaire pourrait être un mécanisme important à l'origine de l'évolution de la nouveauté.

Chez N. vectensis, les cellules piquantes se trouvent dans tout l'épithélium ectodermique, mais chaque région de l'animal est peuplée d'une combinaison distincte de types de cellules piquantes25. Les extrémités des tentacules, par exemple, sont peuplées de grands et petits nématocytes isorhiza basitricheux (cellules perçantes) et de spirocytes graciles (cellules prenantes), tandis que la paroi corporelle (épithélium externe) est peuplée exclusivement de grandes et petites cellules perçantes (Fig. 2a, b). Les épithéliums ectodermiques des mésentères (tissus digestifs) sont peuplés en grande partie de mastigophores microbasiques (un autre type de cellule perçante) et le pied est peuplé presque exclusivement de petites isorhizes basitricheuses (Fig. 2c, d). Les distributions et l'abondance relative des différents types de cellules piquantes sont résumées à la Fig. 2b.

un polype primaire marqué avec du DAPI 143 uM montrant des noyaux et des capsules de nématocytes matures (N = 10 polypes) ; les petites (bleues) et grandes (jaunes) basitriches sont indiquées. En médaillon : les spirocytes graciles (magenta) et les grands basitrichs (jaunes) sont abondants dans les tentacules. b Répartition des types de cellules piquantes chez N. vectensis ; illustration modifiée de : Babonis, LS, Ryan, JF, Enjolras, C. & Martindale, MQ L'analyse génomique du tryptome révèle les mécanismes moléculaires de l'évolution des cellules glandulaires. EvoDevo 10, 23 (2019)—CC BY 4.0. c Les mésentères sont peuplés en grande partie de mastigophores (vert) (N = 12 polypes). d Les petits basitrichs dominent la paroi corporelle et le pied (143uM DAPI) (N = 10 polypes). e NvSox2 et PaxA se chevauchent dans l'expression (N = 8 embryons) ; pointes de flèches blanches : cellules exprimant les deux, pointes de flèches noires : PaxA uniquement, cercles en pointillés : NvSox2 uniquement. f NvSox2 est significativement régulé à la baisse en réponse à l'inactivation de SoxB2 (méthode ddCT, p = 1,12E-2) mais n'est pas significativement affecté par l'inactivation de PaxA (ddCT, p = 0,345957) (qPCR). Les barres d'erreur indiquent + /− écart type. Trois expériences répétées pour chaque traitement sont présentées (points noirs) ; les barres grises indiquent les moyennes des trois expériences. g Modèle de travail. h L'expression de NvSox2 est abolie chez les mutants NvSox2. i Expression de PaxA dans les tentacules (pointe de flèche blanche et encart) et la paroi corporelle (pointe de flèche noire et encart) des types sauvages et des mutants (boîte blanche et encart). j Analyse quantitative des cellules exprimant PaxA dans la paroi corporelle (Mann – Whitney U, p = 1,37E-11). N = 32 (type sauvage) et N = 30 (mutant) animaux ont été examinés par traitement (stade polype primaire). k L'ARNm Mcol1 (magenta) est co-exprimé avec la protéine Mcol4 (α-Mcol4, cyan) dans les tentacules (tête de flèche blanche) et la paroi corporelle (boîte blanche et encart) des types sauvages ; L'expression de Mcol1 est réduite dans la paroi corporelle des mutants NvSox2. Noyaux—blancs, DAPI. l Analyse quantitative des cellules de la paroi corporelle co-exprimant Mcol1 et Mcol4 (Mann–Whitney U, p = 1,57E-4). N = 10 animaux par traitement (stade du bourgeon tentaculaire). Pôle oral à gauche en a, e, i, k. Pour toutes les boîtes à moustaches : médiane—ligne médiane, 25e et 75e centiles—boîte, 5e et 95e centiles—moustaches, valeurs aberrantes—points individuels. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Les images fluorescentes ont été ajustées pour le contraste et la luminosité à l'aide de Fidji.

NvSox2 est l'un des 14 gènes Sox de N. vectensis, dont seulement deux (SoxB2 et NvSox2) sont exprimés dans des cellules individuelles dans tout l'ectoderme, un schéma cohérent avec la spécification de l'identité des cellules terminales au début de l'embryogenèse20. Nous avons examiné plus en détail l'expression de NvSox2 et avons constaté qu'il était co-exprimé avec le facteur de transcription PaxA dans le développement de cellules piquantes (Fig. 2e). Nous avons identifié des cellules exprimant NvSox2 uniquement, des cellules co-exprimant à la fois NvSox2 et PaxA, et des cellules exprimant PaxA uniquement, suggérant une activation séquentielle de NvSox2 puis de PaxA. En utilisant la qPCR en combinaison avec l'inactivation du gène médiée par la morpholino, nous avons constaté une suppression significative de l'expression de NvSox2 après l'inactivation de SoxB2 (exprimée dans les progéniteurs des neurones et des cellules piquantes) 22 et aucun changement significatif dans l'expression de NvSox2 en réponse à l'inactivation de PaxA (Fig. 2f). Ensemble, ces résultats suggèrent que NvSox2 est en aval de SoxB2 et en amont de PaxA dans les cellules piquantes à différenciation précoce (Fig. 2g). Pour comprendre la fonction de NvSox2 dans la spécification des cellules piquantes, nous avons utilisé l'édition du génome médiée par CRISPR / Cas9 pour générer des knock-out homozygotes F2 pour le locus NvSox2 (Fig. 1 supplémentaire). NvSox2 est d'abord exprimé au stade de la blastula et continue à être exprimé tout au long du développement précoce dans des cellules individuelles dispersées dans l'ectoderme ; cette expression est complètement abolie chez les mutants NvSox2 (Fig. 2h, Fig. 2 supplémentaire). Nous avons permis à ces mutants NvSox2 de se développer jusqu'au stade polype pour étudier les effets moléculaires et morphologiques résultant de la perte de NvSox2.

Pour comprendre le rôle moléculaire de NvSox2 dans le destin des cellules piquantes, nous avons examiné l'expression de gènes connus pour être spécifiques aux cellules piquantes chez les animaux de type sauvage et NvSox2 knock-out (mutants)25,26. L'expression du facteur de transcription PaxA (Fig. 2i, j; Fig. 3 supplémentaire) et de la molécule structurale minicollagène-1 (Mcol1; Fig. 2k, l) (tous deux spécifiques aux cellules perçantes) a été significativement réduite dans la paroi corporelle des mutants NvSox2. En revanche, le minicollagène-4 (Mcol4), présent dans tous les types de cellules piquantes, n'a pas été affecté. L'analyse quantitative du développement des cellules piquantes a révélé que 80% des cellules marquées par Mcol4 dans la paroi corporelle des polypes de type sauvage expriment également Mcol1 et cette proportion est significativement réduite à <10% chez les mutants NvSox2 (Fig. 2l). Ces résultats confirment que l'inactivation de NvSox2 n'a pas affecté le nombre total de cellules piquantes spécifiées dans la paroi corporelle, mais a transformé l'identité des cellules piquantes dans ce tissu.

Chez N. vectensis, la paroi corporelle des polypes de type sauvage est peuplée presque exclusivement par un seul type de cellule perçante, la petite isorhize basitricheuse (Fig. 3a)27,28. Pour étudier plus en détail les effets de l'inactivation de NvSox2 sur le développement des cellules piquantes de la paroi corporelle, nous avons examiné la morphologie de ces cellules à l'aide de la microscopie optique et électronique. Chez les mutants NvSox2, les petites cellules perçantes de la paroi corporelle ont été complètement remplacées par un type cellulaire morphologiquement distinct (Fig. 3b). À un niveau brut, le type de cellule mutante avait l'apparence d'un spirocyte robuste (cellule prenante), un type de cellule piquante qui ne se trouve normalement pas chez N. vectensis mais qui est courant chez d'autres anémones de mer (données sources). Nous avons étudié ces cellules mutantes pour trouver des preuves de caractéristiques cellulaires captivantes à l'aide de la microscopie électronique à balayage et à transmission (SEM et TEM, respectivement). Les cellules piquantes de la paroi corporelle des polypes de type sauvage avaient des capsules rigides avec une paroi de capsule épaisse et des volets proéminents à l'extrémité apicale (vers l'extérieur) (Fig. 3c – e). Une fois déchargées, ces cellules piquantes ont révélé un tubule extrusif avec de grandes épines proximales (le "harpon") et de petites barbes distales (Fig. 3f). Ces caractéristiques sont diagnostiques des cellules perçantes des anémones de mer25,29,30. En revanche, la capsule des cellules mutantes extrudées semblait fragile, s'effondrant lors de la décharge, et l'appareil extrusif consistait en un tubule lisse dépourvu d'épines et de barbes (Fig. 3g). Les cellules mutantes ont également une paroi de capsule mince avec un aspect dentelé le long de la surface interne et une calotte apicale plate (Fig. 3h – j), caractéristiques compatibles avec les cellules enserrantes, et non avec les cellules perçantes17,31,32. De plus, des coupes transversales du tubule extrusif intériorisé dans les cellules mutantes ont révélé de petits bâtonnets compatibles avec l'apparition de cellules captrices non déchargées (Fig. 3k), bien que ces bâtonnets soient plus petits et moins nombreux que ce qui a été décrit pour les cellules captrices trouvées chez les animaux de type sauvage17. Sans étiquetage de la lignée cellulaire, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l'inactivation de NvSox2 ait causé à la fois la perte de cellules perçantes et le gain de cellules piégeantes dans deux lignées cellulaires distinctes dans la paroi corporelle de N. vectensis. Considérant que la perte de NvSox2 n'a pas affecté le nombre de cellules piquantes exprimant Mcol4 dans la paroi corporelle, l'explication la plus simple de ces résultats est que la perte de NvSox2 provoque une transformation de petites cellules perçantes en cellules piégeantes dans la paroi corporelle de N. vectensis.

un NvSox2, PaxA et Mcol1 sont nécessaires au développement de petites cellules perçantes (bleues) dans la paroi corporelle ; illustration modifiée de : Babonis, LS, Ryan, JF, Enjolras, C. & Martindale, MQ L'analyse génomique du tryptome révèle les mécanismes moléculaires de l'évolution des cellules glandulaires. EvoDevo 10, 23 (2019)—CC BY 4.0. b Pointes de flèches bleues : petites cellules perçantes ; pointes de flèches blanches : cellules mutantes. M : mésoglée, Ecto : ectoderme. Les cellules sont faussement colorées. Les images correspondent à la zone à l'intérieur de la boîte bleue en a ; N = 2 polypes juvéniles par traitement. c–k Micrographies électroniques de cellules piquantes de la paroi corporelle des polypes juvéniles de type sauvage c–f et mutants g–k (N = 2 individus par traitement). c–e TEM d'une petite cellule de perçage. Les cases en c indiquent les régions mises en évidence en d et e. Les lambeaux apicaux sont faussement colorés en d. Les pointes de flèches noires en e mettent en évidence l'épaisse paroi de la capsule. f SEM d'une petite cellule de perçage. Les structures pertinentes sont faussement colorées : jaune - capsule, vert - volets apicaux, magenta - harpon avec épines, bleu - tubule avec barbes. L'encart en f montre le détail du tubule. g SEM d'une cellule piquante mutante dépourvue d'épines et de barbes. h – k TEM de cellules piquantes mutantes. h Les cases indiquent les régions surlignées en i–k. Les images à fort grossissement montrent i calotte apicale (fausse couleur orange), j paroi de capsule mince et dentelée (têtes de flèche arrière) et k tubule intériorisé avec de courtes tiges latérales (têtes de flèche blanches). l Morphométrie de la capsule (largeur vs longueur) dans les cellules captrices graciles (grises) et robustes (noires) (extraites de la littérature) et les cellules mutantes (orange) (ANCOVA, gracile vs robuste : p = 0,42032, gracile vs mutant : p = 0,30121). N = nombre de cellules analysées. m Largeur de la capsule dans les cellules captrices graciles, mutantes et robustes (ANOVA avec Bonferroni post hoc, gracile vs mutant p = 5,2E-06 ; robuste vs mutant p = 1,3E-11 ; gracile vs robuste p = 2E-16). Moyennes calculées à partir des mêmes données présentées dans le panneau l. n Abondance de cellules avec le phénotype mutant dans les polypes de type sauvage et mutant (Mann–Whitney U, p = 3,2E-5) ; N = 12 polypes primaires par traitement. Pour toutes les boîtes à moustaches : médiane—ligne médiane, 25e et 75e centiles—boîte, 5e et 95e centiles—moustaches, valeurs aberrantes—points individuels. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Malgré les caractéristiques morphologiques canoniques des cellules de capture matures, les cellules qui se sont développées dans la paroi corporelle des mutants NvSox2 étaient morphologiquement distinctes des cellules de capture graciles qui se développent dans les extrémités des tentacules des animaux de type sauvage, ce qui nous amène à émettre l'hypothèse que la perte de NvSox2 a provoqué le développement de cellules de capture robustes dans la paroi corporelle de N. vectensis. Les conditions « robustes » et « graciles » ne sont pas bien définies ; pour remédier à cela, nous avons analysé la longueur et la largeur de la capsule à partir de cellules capturantes non déchargées de la littérature signalées comme étant soit robustes, soit graciles. La relation entre la largeur et la longueur de la capsule ne différait pas pour les cellules capturantes robustes et graciles dans une gamme de tailles (Fig. 3l); cependant, pour une longueur donnée, les cellules de capture robustes étaient significativement plus larges que les cellules graciles (Fig. 3l, m). La largeur de la capsule qui s'est développée dans la paroi corporelle des mutants NvSox2 est distincte et intermédiaire entre la largeur de la capsule rapportée pour les cellules captrices graciles et robustes dans la littérature (Fig. 3m). Étonnamment, l'examen d'animaux de type sauvage a révélé la présence de cellules avec cette morphologie mutante, bien qu'à une fréquence très faible. Alors que le type de cellule mutante représentait près de 50% des cellules piquantes chez les mutants NvSox2, moins de 1% des cellules piquantes des types sauvages avaient cette morphologie (Fig. 3n). Sur les 12 polypes de type sauvage examinés, un seul semblait totalement dépourvu de ces cellules mutantes. Ces résultats suggèrent que des erreurs peuvent survenir spontanément dans la voie de régulation NvSox2 à basse fréquence, entraînant le développement de cellules de capture robustes chez les animaux de type sauvage. Étant donné que les cellules de capture robustes sont courantes et abondantes chez les autres anémones de mer (données sources), il est raisonnable de suggérer que ce type de cellule était probablement présent chez l'ancêtre commun le plus récent de toutes les anémones de mer. Par conséquent, nos résultats suggèrent que l'inactivation de NvSox2 a entraîné un atavisme unicellulaire ou la restauration d'un type de cellule ancestrale (cellule captrice robuste) chez N. vectensis.

Pour étudier plus avant l'identité des cellules captrices, nous avons examiné la distribution et le développement des cellules captrices graciles natives et des cellules captrices mutantes chez N. vectensis. Chez les animaux mutants de type sauvage et NvSox2, des spirocytes graciles n'ont été trouvés que dans les extrémités des tentacules (Fig. 4a); en revanche, de petites cellules perçantes étaient présentes uniquement dans les extrémités des tentacules des animaux de type sauvage et des cellules mutantes piégeantes étaient présentes uniquement dans les tentacules des animaux mutants NvSox2. Ces résultats sont cohérents avec la transformation de petites cellules perçantes en cellules mutantes observées dans la paroi corporelle (Fig. 3), où les petites cellules perçantes sont le type cellulaire prédominant. Pour déterminer si les cellules captrices graciles et mutantes sont moléculairement distinctes, nous avons examiné l'expression d'une protéine de liaison au Ca2+ appelée Calumenin F (CaluF)33. Chez les animaux de type sauvage, CaluF est exprimé exclusivement dans les tentacules, conformément à la distribution des cellules graciles, et est co-exprimé dans des cellules marquées avec un anticorps anti-Mcol425, confirmant qu'il est exprimé dans des cellules piquantes (Fig. 4b). Cependant, CaluF n'est jamais co-exprimé avec le gène spécifique des cellules perçantes, Mcol1 (Fig. 4B) 25 et est donc un marqueur positif et spécifique des cellules captrices graciles. L'inactivation de NvSox2 n'a pas affecté le moment de l'apparition ou la distribution des cellules exprimant CaluF (Fig. 4c), confirmant que les cellules mutantes piégeantes ne sont pas des cellules graciles. De plus, l'analyse de la morphologie des cellules graciles par TEM a confirmé que les cellules graciles d'animaux de type sauvage et mutants sont morphologiquement indiscernables (Fig. 4d – i). À la lumière de ces résultats, nous suggérons que l'inactivation de NvSox2 provoque une transformation homéotique des petites cellules perçantes en cellules de capture robustes partout où de petites cellules perçantes seraient normalement spécifiées. En revanche, la perte de NvSox2 n'a pas affecté le développement des cellules captrices graciles, ce qui suggère que les cellules captrices graciles et robustes sont modelées à l'aide de mécanismes distincts.

a Des cellules graciles capturantes (magenta de fausse couleur) sont présentes dans les extrémités des tentacules des animaux de type sauvage (N = 5) et des mutants NvSox2 (N = 4); les petites cellules perçantes (bleues) ne se trouvent que dans les types sauvages et les cellules capturantes robustes (orange) ne se trouvent que chez les mutants. Les couleurs correspondent à la Fig. 2b. Pôle oral à gauche en a–c. b CalumeninF (CaluF) est un marqueur spécifique des cellules captrices graciles. Mcol4 (cyan) et Mcol1 (magenta) sont co-exprimés dans les tentacules et la paroi corporelle (pointe de flèche noire ; encart) (N = 6 animaux). CaluF (jaune) est exprimé uniquement dans les tentacules. Encarts : CaluF est co-exprimé avec Mcol4 (pointes de flèche blanches) mais jamais avec Mcol1 (magenta). c Le knock-out de NvSox2 n'a pas affecté le début de l'expression de CaluF ni la distribution des cellules exprimant CaluF. Toutes les barres d'échelle en c : 50 um. Chaque panel est représentatif d'au moins 10 individus à chaque étape. d–i TEM de cellules captrices graciles de polypes juvéniles de type sauvage (N = 3) et mutants (N = 2). Le knock-out de NvSox2 n'a pas affecté la morphologie de la paroi dentelée de la capsule (têtes de flèches blanches) ou les tiges latérales sur le tubule intériorisé (têtes de flèches noires). Les images fluorescentes ont été ajustées pour le contraste et la luminosité à l'aide de Fidji.

Chez N. vectensis, l'épithélium de l'extrémité des tentacules de type sauvage est peuplé de petites cellules perçantes (rares), de grandes cellules perçantes (abondantes) et de cellules captrices graciles (abondantes) (Fig. 2b) 25,26,28. L'examen des extrémités des tentacules par microscopie optique a confirmé que les petites cellules de perçage étaient complètement transformées en cellules de capture robustes, reflétant les effets dans la paroi corporelle, mais de grandes cellules de perçage sont présentes à la fois chez les animaux de type sauvage et mutants (Fig. 5a). Les grandes cellules perçantes semblaient initialement non perturbées par la perte de NvSox2 car il n'y avait aucun changement détectable dans la distribution de ces cellules ou l'expression de PaxA ou Mcol1 dans les extrémités des tentacules (Fig. 2i, k); cependant, en utilisant un tyramide conjugué à H2O2 pour étiqueter les harpons des cellules perçantes, nous montrons que les animaux mutants présentent une morphologie de harpon aberrante (Fig. 5b). Plus précisément, la partie proximale du harpon est apparue en boucle dans les grandes cellules de perçage des animaux mutants, par rapport au harpon droit trouvé dans les polypes de type sauvage. Pour évaluer les changements dans l'abondance des cellules perçantes à l'extrémité des tentacules, nous avons compté le nombre de harpons marqués par rapport au nombre total de noyaux et avons montré une perte significative (~ 20%) de cellules perçantes chez les animaux mutants (Fig. 5c). Ce résultat est cohérent avec la transformation des petites cellules de perçage dans les extrémités des tentacules en cellules de capture robustes (Fig. 5a) et suggère que les petites cellules de perçage comprennent environ 20 % des cellules de perçage dans la pointe des tentacules d'animaux de type sauvage. Pour étudier plus avant leur morphologie aberrante de harpon, nous avons induit la décharge de cellules de perçage de la pointe des tentacules dans les polypes de type sauvage et mutant à l'aide d'un système d'ablation laser infrarouge (XY Clone, Hamilton Thorne, États-Unis) (Films supplémentaires 1, 2). L'examen des cellules de perçage déchargées a suggéré que le phénotype en boucle des mutants est dû à l'allongement du harpon (Fig. 5d, e). Pour quantifier cet effet, nous avons mesuré la longueur du harpon et la longueur de la capsule dans les cellules piquantes déchargées des extrémités des tentacules des polypes de type sauvage et mutant et avons montré une augmentation significative (~ 50%) de la longueur du harpon chez les animaux mutants (Fig. 5f).

a De grandes cellules perçantes (fausse couleur jaune) sont présentes dans les extrémités des tentacules des animaux de type sauvage (N = 5) et des mutants NvSox2 (N = 4) ; les petites cellules perçantes (bleu) et les spirocytes robustes (orange) sont également indiqués. Les couleurs correspondent à la Fig. 2b. b Les harpons (magenta) des grandes cellules perçantes chez les mutants NvSox2 ont une morphologie aberrante (en boucle). Noyaux—blancs (DAPI). c L'abondance des cellules perçantes est significativement plus faible dans les extrémités des tentacules des mutants NvSox2 que dans les types sauvages (Mann – Whitney U, p = 1,6E-4). N = 11 polypes primaires par traitement. d Images fixes de vidéos de décharge de cellules piquantes induites par laser (films supplémentaires S1 et S2). Les pointes de flèches blanches indiquent la transition du harpon au tubule. La zone encerclée en rouge montre la cible laser (déplacée après la décharge). e Grandes cellules perçantes après décharge induite ; la capsule, le harpon et le tubule sont de fausse couleur. Les tubules ne se déchargent pas complètement et semblent courts chez les mutants. f Les harpons sont significativement plus longs dans les grandes cellules perçantes d'animaux mutants que dans les types sauvages (Mann – Whitney U, p = 2,1E-13). Nombre de cellules analysées : N = 57 (type sauvage), N = 41 (mutant). g La morphologie en harpon en boucle (tête de flèche blanche) est présente dans les mastigophores macrobasiques de l'anémone de mer Cylista elegans (N = 2 individus) ; un mastigophore microbasique de la même espèce est également représenté. h La morphologie des mastigophores microbasiques (cellules perçantes) dans les mésentères de N. vectensis n'a pas été affectée par l'inactivation de NvSox2 (N = 6 animaux chacun). Les harpons (pointes de flèches blanches) sont étiquetés comme en b. i Schéma du rôle de NvSox2 dans la conduite de la morphogenèse du harpon dans les grandes cellules perçantes. Le knock-out de NvSox2 n'affecte pas l'expression de PaxA ou Mcol1 dans cette lignée cellulaire mais augmente la longueur du harpon (boîte magenta). Les harpons allongés doivent être bouclés pour tenir à l'intérieur de la capsule. Pour toutes les boîtes à moustaches : médiane—ligne médiane, 25e et 75e centiles—boîte, 5e et 95e centiles—moustaches, valeurs aberrantes—points individuels. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Les images fluorescentes ont été ajustées pour le contraste et la luminosité à l'aide de Fidji.

Le harpon en boucle des grandes cellules perçantes des extrémités des tentacules des mutants NvSox2 phénocopie l'apparence en boucle du harpon dans un type de cellule perçante que l'on trouve chez d'autres espèces d'anémones de mer : le mastigophore macrobasique34. Dans les cellules de perçage macrobasiques, le harpon est plus long que la capsule dans laquelle il est contenu, de sorte que le harpon doit faire une boucle pour s'adapter à l'intérieur de la capsule; cette condition est démontrée par un mastigophore macrobasique de l'anémone de mer Cylista elegans (Fig. 5g). En revanche, les cellules microbasiques développent un harpon plus court que la longueur de la capsule, de sorte que le harpon s'adapte complètement à l'intérieur de la capsule sans faire de boucle. Chez N. vectensis, tous les mastigophores sont microbasiques et ne se trouvent que dans les épithéliums ectodermiques du tube digestif (Fig. 2b). Le knock-out de NvSox2 n'a pas affecté la taille des harpons mastigophores chez N. vectensis, car tous les mastigophores ont conservé la morphologie microbasique chez les animaux de type sauvage et mutants (Fig. 5h). Alors que le rôle de NvSox2 dans la conduite de l'allongement du harpon semble être limité aux grandes cellules perçantes (isorhizes basitricheuses) chez N. vectensis, ce contrôle monogénique du développement du harpon (Fig. 5I) fournit un mécanisme par lequel la condition macrobasique du harpon aurait pu évoluer plusieurs fois, indépendamment, dans d'autres types de cellules piquantes35.

Les gènes Sox sont omniprésents parmi les génomes animaux et se regroupent en 8 grands groupes (SoxA-SoxH)19, dont au moins quatre étaient probablement présents chez l'ancêtre commun des cnidaires et des vertébrés (SoxB, SoxC, SoxE, SoxF). Des analyses phylogénétiques antérieures des gènes Sox de N. vectensis ont suggéré que NvSox2 est soit un orthologue20 spécifique aux cnidaires, soit un membre du clade SoxB24,36,37. Pour tester davantage ces hypothèses, nous avons construit une phylogénie à maximum de vraisemblance des gènes Sox de 15 cnidaires et 6 bilatéraux (Fig. 5 supplémentaire; Données supplémentaires 1). Avec cet échantillonnage étendu de taxons, nous trouvons un soutien solide pour la monophylie d'un clade comprenant des orthologues NvSox2 de coraux et d'anémones de mer, mais un faible soutien liant le clade NvSox2 à tous les gènes Sox bilatéraux connus. De plus, nous ne trouvons aucune preuve d'un orthologue de NvSox2 chez les médusozoaires, les octocoraux ou les cérianthes (anémones tubulaires), suggérant que NvSox2 est apparu dans l'ancêtre de la tige des coraux et des anémones de mer (hexacoraux non cérianthides), après l'origine des cellules piégeantes (spirocytes) (Fig. 1m).

Bien que les petites et grandes cellules perçantes aient été supposées être deux classes de taille du même type de cellule25, nous montrons qu'il s'agit en fait de deux types moléculairement distincts de cellules piquantes. En l'absence de NvSox2, les petites cellules perçantes ont pris une nouvelle identité (envoûtante) (Fig. 6a), mais la perte de NvSox2 était insuffisante pour modifier l'identité cellulaire dans les grandes cellules perçantes. Ainsi, NvSox2 est requis pour le développement d'une suite de traits associés au phénotype perçant dans les petites cellules perçantes (par exemple, des épines basales et une capsule épaisse avec des volets apicaux) (Fig. 3) et un seul trait (longueur du harpon) dans les grandes cellules perçantes (Fig. 5). Au cours de l'évolution, l'intégration de NvSox2 dans la lignée robuste des cellules captrices semble avoir permis l'origine parallèle du phénotype des cellules perçantes (Fig. 6b). De manière critique, cela suggère que les cellules perçantes (" nématocytes ") et les cellules capturantes (" spirocytes ") ne sont pas aussi distinctes phylogénétiquement qu'on le pensait autrefois, mais représentent plutôt deux destins alternatifs de cellules piquantes contrôlées par un seul gène.

un NvSox2 est requis pour la spécification des petites cellules perçantes (nématocytes, bleu) ; les cellules captrices (spirocytes, magenta) sont spécifiées en l'absence de NvSox2. b Un scénario pour la cooptation évolutive d'une cellule capturante ancestrale avec une capsule et un tubule éversible pour générer une cellule perçante avec une paroi de capsule épaisse, des volets apicaux, un harpon épineux et un tubule. c Les anémones de mer du genre Edwardsiella illustrent les rôles possibles de NvSox2 dans la conduite des transitions entre les cellules perçantes et les cellules piégeantes lors de l'adaptation à différents habitats. E. ignota et E. andrillae sont des taxons frères ; E. ignota s'enfouit dans le sable/la boue et a des cellules perçantes dans sa paroi corporelle et E. andrillae s'enfouit dans la glace de mer et a des cellules piégeantes dans sa paroi corporelle. E. lineata et E. carnea passent toutes deux d'un état de vie libre (s'enfouissant dans le sable / la boue) à un état parasitaire dépourvu de tentacules; ce changement est reflété par une transition entre les types de cellules piquantes. Illustrations d'anémones de mer modifiées à partir de : Babonis, LS & Martindale, MQ PaxA, mais pas PaxC, est nécessaire pour le développement des cnidocytes chez l'anémone de mer Nematostella vectensis. EvoDevo 8, 14 (2017) —CC BY 4.0. d L'homéose monogénique fournit une explication mécaniste de la variation large et discontinue des types de cellules piquantes observée dans la paroi corporelle de cnidaires étroitement apparentés de différents habitats. Les cellules piégeantes (boîte magenta) se trouvent dans les coraux durs, les anémones de mer et les anémones tubulaires et sont probablement apparues dans le dernier ancêtre commun de ce clade. Les anémones tubulaires n'ont pas d'orthologue de NvSox2, ce qui suggère que ce gène est apparu dans l'ancêtre de la tige des coraux durs et des anémones de mer. L'incorporation de NvSox2 dans le réseau de régulation des gènes à l'origine du développement de cellules capturantes ancestrales dans la paroi corporelle de certaines anémones de mer (par exemple, N. vectensis et E. ignota) explique pourquoi ces taxons ont maintenant des cellules perçantes (basitrichs; boîte bleue) dans la paroi corporelle alors que leurs proches parents (par exemple, les mutants N. vectensis et E. andrillae, respectivement) ont des cellules capturantes à la place. Le contrôle par un seul gène de l'identité cellulaire pourrait également entraîner des transitions homéotiques dans la diversité piquante de ce clade. Type sauvage WT.

La transformation homéotique de l'identité cellulaire explique comment le complément des cellules piquantes trouvées chez deux cnidaires étroitement apparentés peut différer de manière assez spectaculaire. Les anémones de mer fouisseuses se trouvent dans une grande variété d'habitats et fournissent une illustration précieuse de ce phénomène (Fig. 6c). Alors que certaines espèces se trouvent dans un habitat sablonneux (comme Nematostella vectensis et Edwardsiella ignota), d'autres s'enfouissent dans la banquise (comme Edwardsiella andrillae)38. Une transition évolutive des cellules de capture robustes trouvées dans la paroi corporelle d'E. andrillae aux petites cellules perçantes trouvées dans la paroi corporelle d'E. ignota pourrait s'expliquer par l'incorporation de l'orthologue NvSox2 dans le réseau de régulation des gènes entraînant le développement de cellules piquantes de la paroi corporelle chez E. ignota mais pas E. andrillae. De même, les espèces sœurs E. lineata et E. carnea subissent toutes deux une transition écologique au cours de leur vie, passant d'un état de vie libre (s'enfouissant dans le sable/la boue) à un état parasitaire (s'enfouissant dans le tube digestif d'un cténophore)39 ; cette transition s'accompagne d'une transformation des types de cellules urticantes dans la paroi corporelle à ces deux stades de vie différents. Les cellules perçantes se trouvent dans la paroi corporelle des individus vivant en liberté; alors que l'identité spécifique des cellules piquantes dans la paroi corporelle de ces animaux au cours de leur stade parasitaire a été débattue40,41, elles sont très similaires en morphologie aux cellules piégeantes robustes identifiées dans nos mutants NvSox2. Cela suggère qu'un événement homéotique unicellulaire similaire peut réguler le changement d'identité des cellules piquantes associé aux habitats variables utilisés par chaque étape de la vie. Ce scénario pourrait également expliquer les nombreuses transitions entre les types de cellules urticantes distinctes trouvées dans la paroi corporelle d'autres anémones de mer fouisseuses qui envahissent des habitats uniques, fournissant une explication de la variation discontinue des types de cellules urticantes trouvées parmi les espèces étroitement apparentées à travers Cnidaria (Fig. 6d) 40,41.

Nous avons montré que l'inactivation d'un seul facteur de transcription (NvSox2) faisait que les cellules perçantes adoptaient la morphologie (Fig. 3) et la signature moléculaire (Figs. 2 et 4) des cellules captrices et que ces cellules mutantes conservaient la capacité de se décharger. Ensemble, ces résultats confirment que cette mutation est fonctionnellement pertinente et est donc une véritable transformation homéotique7. Fait important, la transformation a entraîné la restauration d'un type de cellule piégeante qui a été perdu dans l'ancêtre de la lignée qui a donné naissance à Nematostella vectensis. Ainsi, nous avons montré un cas particulier d'homéose : l'atavisme unicellulaire, ou la restauration d'un type cellulaire ancestral chez une espèce moderne. Comme il s'agit de la première preuve d'atavisme chez un cnidaire, nos résultats suggèrent que le contrôle homéotique du destin cellulaire est un mécanisme ancien qui a contribué à l'expansion de la biodiversité depuis le dernier ancêtre commun des cnidaires et des bilatériens, plus de 800 millions d'années42.

Notre capacité à ressusciter un type de cellule ancestrale en manipulant un seul gène démontre comment l'homéose relie la flexibilité du développement aux pressions de sélection environnementales pour favoriser l'émergence de nouveaux types de cellules. Plus précisément, la capacité de faire taire les propriétés fonctionnelles des types de cellules ancestrales tout en conservant les instructions pour leur spécification permet aux animaux une flexibilité extrême tout en explorant de nouveaux habitats. À l'appui de cette idée, il a été découvert qu'un seul gène régulateur contrôlait un changement homéotique dans le motif de couleur des ailes de papillon, fournissant un mécanisme par lequel une évolution morphologique rapide peut se produire lorsqu'un phénotype multicellulaire est contrôlé par un seul interrupteur génétique43. Ces exemples démontrent comment la capacité de sélectionner parmi plusieurs identités cellulaires possibles avec un seul gène peut créer des opportunités efficaces d'adaptation aux conditions locales. La capacité de redéployer des types cellulaires réduits au silence peut donc être un mécanisme macroévolutif répandu, mais sous-estimé, pour générer la diversité des types cellulaires chez les animaux.

L'observation selon laquelle NvSox2 contrôle la morphogenèse du harpon - et non la spécification - dans les grandes cellules perçantes récapitule la variation phénotypique observée dans une autre lignée de cellules piquantes (mastigophores; Fig. 5). Le fait que NvSox2 ne contrôle que la longueur du harpon dans les grandes cellules perçantes suggère qu'il devrait être possible de trouver des gènes individuels qui contrôlent de la même manière la morphologie des épines, le nombre de barbes, la composition de la paroi de la capsule et la forme des structures apicales. En effet, une étude récente de la fonction des cellules perçantes chez N. vectensis a identifié une protéine de type spinaline44 comme un composant spécifique du harpon45. De futures études portant sur les relations régulatrices des facteurs de transcription, comme NvSox2, et les gènes effecteurs à l'origine de la morphologie du harpon, y compris de type spinaline, sur une cellule unique offriront une occasion unique de reconstruire la diversification évolutive de chaque type de cellule piquante individuelle et conduiront à une meilleure compréhension de l'évolution des réseaux de régulation des gènes. Semblable au contrôle modulaire de l'identité neurale décrit à partir des nématodes46, ce cadre explique comment l'évolution pourrait mélanger et assortir les gènes contrôlant les aspects fins du phénotype subcellulaire pour produire le large éventail de types de cellules qui animent la biodiversité animale et fournit un modèle pour caractériser l'évolution d'autres nouveaux organites.

Le locus NvSox2 a été supprimé en utilisant une modification de deux protocoles CRISPR/Cas9 publiés47,48. En bref, cinq ARN guides ont été conçus pour cibler différents sites dans le locus NvSox2, quatre dans la séquence codante et un dans le 5 'UTR (Fig. 1 supplémentaire, tableau 1). Les ARN guides ont été achetés auprès de Synthego (USA) et reconstitués à 30 uM dans de l'eau sans nucléase (Synthego) en suivant les instructions du fabricant. La protéine Cas9 (PNABio CP01-50) a été reconstituée à 1 mg/ml dans de l'eau sans nucléase (Ambion AM9937) en suivant les instructions du fabricant. Les ARN guides ont été mélangés avec Cas9 dans un rapport de 5: 4 (vol: vol) gRNA: Cas9, incubés à température ambiante pendant 10 min et injectés dans des zygotes avec 0, 2 mg / ml de dextran sans ARNse Alexa-555 (Invitrogen D34679) et de l'eau sans nucléase (Ambion). Pour déterminer s'il y avait des effets non spécifiques des ARN guides ou de Cas9, des embryons témoins ont été injectés avec des ARN guides mais pas de protéine Cas9 ou avec la protéine Cas9 seule. Ces animaux se sont développés normalement et n'ont pas été examinés davantage. Des embryons mutants Mosaic F0 NvSox2 ont été élevés jusqu'à maturité reproductive à 16 °C et pondus pour générer la génération F1. L'ADN génomique a été extrait des extrémités des tentacules des polypes F1 et séquencé pour vérifier les mutations. Une femelle F1 et un mâle F1 ont été identifiés comme ayant des délétions importantes dans le locus NvSox2 (Fig. 1 supplémentaire) et ont été utilisés pour produire la génération F2. Toutes les autres analyses de cellules/tissus ont été effectuées dans la génération F2.

Pour tester les effets de l'inactivation de NvSox2 sur le développement des cellules piquantes, les cellules piquantes immatures ont été marquées pendant une nuit à 4 C avec un anticorps dirigé contre le minicollagène-4 (α-Mcol4) 25, 26 dilué au 1/1000 dans du sérum de chèvre normal (Sigma G9023) (Fig. 4 supplémentaire) et les cellules piquantes matures (cellules perçantes uniquement) ont été marquées pendant 30 minutes à 25 C dans du DAPI à haute concentration ( 143 uM dans du PBS avec 0,1 % de Tween et 10 mM d'EDTA)25,26,49. L'expression embryonnaire de NvSox2, PaxA, Mcol1 et CaluF a été examinée à l'aide de l'hybridation in situ (ISH) selon les protocoles établis50,51. Pour obtenir une ISH fluorescente à deux couleurs, les échantillons ont été incubés simultanément dans des sondes d'ARNm marquées à la digoxygénine et à la fluorescéine pendant une nuit à 63 ° C. Les sondes ont ensuite été détectées séquentiellement à l'aide d'anticorps anti-DIG/POD et anti-FL/POD (Roche 11207733910, 11426346910) et de tyramide couplé à la fluorescéine ou au Cy3.

Les animaux en développement ont été fixés pour examen au stade du bourgeon tentaculaire (240 h après la fécondation à 16 C). Pour co-localiser l'ARNm de Mcol1 et la protéine Mcol4, nous avons effectué une ISH fluorescente suivie d'une immunohistochimie dans les mêmes tissus26. Les tissus marqués ont ensuite été montés dans du glycérol sur des lames de verre, imagés avec un microscope confocal Zeiss 710, et les piles z ont été rendues en images 3D à l'aide du logiciel Imaris v 7.6.1 (Oxford Instruments, USA). Les régions d'intérêt ont été délimitées à l'aide de l'outil de recadrage dans Imaris et les cellules marquées ont été comptées à l'œil nu dans une région carrée d'intérêt de 100 × 100 um en amont des bourgeons de tentacule. Nous avons comparé le nombre de cellules marquées avec α-Mcol4 chez les mutants de type sauvage et NvSox2 à l'aide d'un test U Mann – Whitney bilatéral et n'avons trouvé aucune différence significative dans le nombre total de cellules marquées α-Mcol4 (p = 0, 623176). Nous avons ensuite compté le nombre de cellules dans la même région d'intérêt qui co-exprimaient Mcol1 et Mcol4 et avons trouvé une diminution significative des mutants NvSox2, par rapport aux animaux de type sauvage (p = 1,57E-4). Les données sont présentées (Fig. 2l) en pourcentage de cellules marquées avec l'anticorps α-Mcol4 qui ont également été marquées avec la sonde d'ARNm Mcol1. N = 10 animaux au stade de bourgeon tentaculaire ont été examinés dans chaque traitement.

Pour déterminer si NvSox2 faisait partie du réseau de régulation des gènes des cellules piquantes, nous avons renversé SoxB2 et PaxA à l'aide de morpholinos (GeneTools, LLC) qui ont été validés précédemment (séquences fournies dans le tableau 1). Les morpholinos ont été reconstitués à 1 mM dans de l'eau sans nucléase (Ambion) et conservés à l'obscurité jusqu'au jour de l'utilisation, en suivant les instructions du fabricant. Le jour de l'injection, les morpholinos (MO) ont été chauffés à 65 °C pendant 10 min, centrifugés à 25 °C pendant 1 min et dilués à 0,9 mM dans de l'eau sans nucléase avec du dextran fluorescent à une concentration finale de 0,2 mg/ml. Pour l'analyse qPCR, trois répliques de chaque condition (type sauvage/non injecté, contrôle MO, SoxB2 MO et PaxA MO) représentant trois injections indépendantes effectuées à des jours différents ont été comparées à l'aide de la méthode delta-delta CT et du package PCR dans l'environnement informatique statistique R52,53. Les valeurs d'expression pour l'analyse qPCR sont présentées sous forme de changement de pli, par rapport à l'expression du facteur d'élongation du gène domestique 1β (EF1β) normalisé à 1,0 dans les embryons non injectés et la signification statistique a été calculée à partir de la comparaison des embryons injectés SoxB2 MO et PaxA MO pour contrôler les embryons injectés MO.

La taille et l'abondance des cellules mutantes ont été mesurées dans des polypes primaires dissociés (stade à 4 tentacules) par préparation de courge dans N = 12 polypes par condition (type sauvage et mutant NvSox2). Chaque polype a été immobilisé dans du MgCl2 à 7,14 %, fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS avec du Tween à 0,1 % (PTw) pendant 2 h à 4 °C, lavé abondamment dans du PTw et monté individuellement dans un volume minimal de glycérol sur une lame de verre. Une lamelle de verre a été abaissée sur le tissu fixé et écrasée/enduite pour dissocier le polype fixé. Le nombre de cellules mutantes est présenté comme le nombre de cellules mutantes par rapport au nombre de cellules perçantes comptées en même temps dans trois transects visuels non chevauchants à travers le tissu dissocié. La taille des cellules a été évaluée dans des images non superposées capturées le long de ces transects à l'aide de l'outil de mesure à Fidji v 1.53 f (ImageJ)9.

Une méthode d'étiquetage des harpons (la partie épineuse basale des tubules éversibles dans les cellules perçantes) à l'aide de tyramide couplé à Cy3 a été développée pour cette étude. Les polypes primaires ont été fixés pendant 1 min à 25 C dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PTw avec du glutéraldéhyde à 0,2 % et pendant 1 h à 4 C dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PTw. Les tissus fixés ont été lavés deux fois dans de l'eau sans nucléase pour éliminer le PTw et stockés dans du méthanol à 100 % à -20 °C jusqu'à utilisation. Pour la coloration, les tissus ont été lentement réhydratés du méthanol dans du PTw, puis lavés trois fois (20 min chacun) dans du PTx (PBS avec 0,2 % de Triton) et trois fois (20 min chacun) dans du H2O2 à 3 % à 25 °C. 2) pendant 45 minutes dans le noir. L'excès de tyramide et de H2O2 a été éliminé avec trois lavages en PTw et les polypes ont été contre-colorés avec du DAPI 1 uM pendant 30 minutes avant d'être montés sur des lames de verre dans du glycérol et légèrement comprimés sous une lamelle stabilisée avec des pieds d'argile. L'imagerie a été réalisée le même jour que le marquage sur un confocal Zeiss 710. Les piles Z ont été rendues en images 3D à l'aide d'Imaris et les régions d'intérêt ont été délimitées à l'aide de l'outil Recadrage. Les harpons marqués de N = 11 polypes par condition (type sauvage ou mutant) ont été comptés à l'œil nu et les noyaux ont été comptés automatiquement à l'aide de l'outil Spots. La taille du harpon et la taille de la capsule ont été mesurées sur des images non superposées de pointes de tentacules capturées après la décharge induite par laser de cellules piquantes à l'aide de l'outil de mesure à Fidji54.

Pour induire la décharge des cellules piquantes, des polypes juvéniles (stade 6 tentacules) ont été immobilisés pendant 5 minutes dans du MgCl2 à 7,14 % et montés sur des lames de verre et légèrement comprimés sous des lamelles stabilisées avec des pieds d'argile. Un système d'ablation laser infrarouge (XY Clone, Hamilton Thorne) monté sur l'objectif 20X d'un axioscope Zeiss a été utilisé pour induire une décharge des cellules piquantes de la pointe des tentacules avec une puissance de 100 % et une impulsion de 500 us.

Avant de commencer toute analyse, des expériences ont été planifiées et décrites dans un Phylotocol55. Les modifications ultérieures des analyses ont été notées et justifiées dans ce document. De nombreux gènes en plus des gènes Sox incluent une boîte HMG, donc la recherche de gènes Sox en utilisant uniquement le modèle de markov caché HMG (HMM) a produit de nombreuses séquences non cibles. Pour identifier spécifiquement les gènes Sox, nous avons généré un HMG HMM personnalisé à partir d'un alignement de gènes Sox publié56 après avoir supprimé les séquences de l'exogroupe (Tcf/Lef et Capicua/CIC) à l'aide de hmmbuild (hmmer.org). Nous avons ensuite utilisé ce HMM personnalisé pour rechercher des gènes Sox dans les transcriptomes traduits de 15 cnidaires et six bilatéraux. Les abréviations des taxons cnidaires que nous avons utilisées sont les suivantes : Aala —Alatina alata, Adig—Acropora digitifera, Amil—Acropora millepora, Epal—Exaiptasia pallida, Avan—Atolla vanhoeffeni, Ccrux—Calvadosia cruxmelitensis, Came—Ceriantheopsis americana, Chem—Clytia hemisphaerica, Cxam—Cassiopea xamachana , Elin-Edwardsiella lineata, Hech-Hydractinia echinata, Hmag-Hydra magnipapillata, Hsan-Haliclystus sanjuanensis, Nvec-Nematostella vectensis, Rren-Renilla reniformis; et pour les bilatériens : Bflo—Branchiostoma floridae, Cint—Ciona intestinalis, Cele—Caenorhabditis elegans, Dmel—Drosophila melanogaster, Hsap—Homo sapiens, Lgig—Lottia gigantea, Spur—Strongylocentrotus purpuratus. Nous avons utilisé ce HMM personnalisé en combinaison avec notre script hmm2aln (https://github.com/josephryan57) pour générer un alignement incluant les séquences originales utilisées pour générer le HMM. Nous avons ensuite supprimé toutes les séquences de cténophores, d'éponges et de placozoaires de cet alignement et généré des arbres.

L'analyse phylogénétique a été réalisée selon un protocole publié58. En bref, nous avons utilisé la fonction de recherche de modèle avec IQ-TREE pour identifier le meilleur modèle de substitution pour l'alignement (fourni en tant que données supplémentaires 1). Nous avons ensuite effectué trois analyses de vraisemblance maximale, en parallèle, en utilisant : RAxML avec 25 arbres de départ à parcimonie maximale, RAxML avec 25 arbres de départ aléatoires et une exécution par défaut avec IQ-TREE. Nous avons ensuite comparé les valeurs de vraisemblance maximales des résultats des trois analyses pour sélectionner le meilleur arbre et effectué 1 000 bootstraps rapides à l'aide de RAxML pour la prise en charge des branches. Le fichier d'arbre final a été modifié dans FigTree v1.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) et Adobe Illustrator v 24.1.1 pour la présentation.

Les comparaisons par paires des données de comptage (Fig. 2j, l, Fig. 3n et Fig. 5c, f) ont été analysées avec un test U bilatéral de Mann – Whitney dans Microsoft Excel v 2122. .2.1)52,53. Les micrographies électroniques de cellules urticantes matures d'animaux de type sauvage (Fig. 1, Fig. 3c – f) sont des images représentatives d'au moins trois cellules du type indiqué (nématocyte, spirocyte ou ptychocyte) prélevées sur au moins deux individus. Les micrographies électroniques de mutants NvSox2 (Fig. 3g – k) sont des images représentatives d'au moins deux cellules de deux individus. Nombre exact de cellules imagées de chaque individu : Fig. 3g (N = 6,15), Fig. 3h (N = 12,15), Fig. 3i (N = 2,2), Fig. 3j (N = 5,7), Fig3k (N = 4,5), Fig. 4g (N = 9,10), Fig. 4h (N = 5,7), Fig. 4i (N = 7,8).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude, y compris les données sources, sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires). Les animaux transgéniques seront mis à disposition sur demande auprès de l'auteur correspondant, en attendant la conclusion d'un accord de transfert de matériel. Les données sources sont fournies avec ce document.

Nous avons utilisé un script personnalisé (hmm2aln) pour aligner les HMM pour l'analyse phylogénétique. Ce script est disponible sur : https://github.com/josephryan57.

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La microscopie électronique a été réalisée au Biological Electron Microscope Facility (BEMF) de l'Université d'Hawai'i, Mānoa, et au Center for Electron Microscopy and Analysis (CEMAS), au Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) et à l'OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR) à l'Ohio State University (OSU). Nous sommes reconnaissants à Jeffrey Tonniges pour son aide à la préparation des échantillons pour TEM à l'OSU. Financement : ce travail a été soutenu par un financement de la National Aeronautics and Space Administration à MQM (#NNX14AG70G), de la National Science Foundation à JFR (#1542597) et des fonds de recherche institutionnels de l'OSU et de l'Université Cornell à MD et LSB, respectivement.

Whitney Laboratory for Marine Bioscience, Université de Floride, St. Augustine, Floride, États-Unis

Leslie S. Babonis, Camille Enjolras, Brent M. Foster, Fredrik Hugosson, Joseph F. Ryan et Mark Q. Martindale

Département d'écologie et de biologie évolutive, Cornell University, Ithaca, NY, États-Unis

Leslie S. Babonis

National Systematics Laboratory, Office of Science and Technology, NOAA Fisheries, Washington DC, États-Unis

Abigail J.Reft

Département de zoologie des invertébrés, Smithsonian National Museum of Natural History, Washington DC, États-Unis

Abigail J.Reft

Département de biologie, Université de Floride, Gainesville, Floride, États-Unis

Joseph F. Ryan et Mark Q. Martindale

Département d'évolution, d'écologie et de biologie des organismes, Université d'État de l'Ohio, Columbus, OH, États-Unis

Mary Megan Daly

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LSB, CE, BMF, FH et MQM ont effectué des procédures de laboratoire, notamment le développement de réactifs CRISPR, la microinjection, l'ISH, le clonage et l'analyse de séquences, et la microscopie confocale. LSB, AJR et MD ont effectué une microscopie électronique et analysé les phénotypes des cellules mutantes. LSB et JFR ont effectué des analyses phylogénétiques. LSB a conçu l'étude et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont édité le manuscrit et approuvé la version finale.

Correspondance à Leslie S. Babonis.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Babonis, LS, Enjolras, C., Reft, AJ et al. L'atavisme unicellulaire révèle un ancien mécanisme de diversification des types cellulaires chez une anémone de mer. Nat Commun 14, 885 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36615-9

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Reçu : 28 février 2022

Accepté : 09 février 2023

Publié: 16 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36615-9

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